25羥維生素-D3D3）elisa試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將待測物質和標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中指標的濃度呈比例關系。

自備材料：

1、蒸餾水。

2、加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

3、振蕩器及磁力攪拌器等。

樣品收集、處理及保存方法：

1、血清：操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、血漿：EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細胞上清液：1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。

4、組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

5、保存：如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項：

1、試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

2、實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

3、不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

4、使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5、使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6、底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

7、加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

安全性：

1、避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2、實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3、不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

試劑盒性能：

1、靈敏度：小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2、特異性：不與其它細胞因子反應。

3、重復性：板內、板間變異系數均小于10%。

操作步驟：

1、使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

2、根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

3、加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

4、甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5、每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6、甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7、每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

8、取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

9、在450nm波長處測定各孔的OD值。

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